FBS 계정을 여는 방법
(본 자료는 예전 실험Talk에서 이관되었습니다.)
아무래도 동결액 자체에 cell에 damage주는 DMSO 등이 포함되어있기때문에
최대한 빨리 deep freezer에 넣어주는것이고
1분동안 1도가 떨어지는 탱크 비슷한 것이 있는데요,
거기에 vial을 우선 두고 -70도 보관했다가
이전 실험실에서 cell stock 만들 때
FBS와 DMSO를 따로 첨가해주어야해서 불편함이 있었습니다.
그런데 이 제품은 바로 cell을 down시켜 이 solution에 풀고
바로 vial에 넣어 deep freezer 혹은 LN2 보관가능하여 편합니다.
저도 처음사용해보았으나 cell을 다시 풀었을 때 viability도 나쁘지 않았습니다.
Revive Organtech은 미국 CA,얼바인시에 소재한 바이오텍 입니다.
세포동결에는 일반적으로 FBS+10% DMSO를 혼합한 제제를 홈메이드 방식으로 사용하고 있습니다. 위의 방법은 수십년동안 세포주들을 동결보존하는데 값싸고 문제없이 사용이 되었습니다.
하지만 현재 FBS을 사용하는 홈메이드 방법에는 여러가지 문제가 있는것이 현실입니다.
첫번째로 FBS의 가격이 계속적으로 급등함으로 인해 동결보존액에 FBS를 사용하는것이 부담으로 작용하고 있습니다. 또한 혈청을 이용해 제작한 홈메이드 동결보존액의 제조후 sterility유지한는것이 매우 어렵고, pH변화가 있어서 제조후 2주이내만 사용이 가능하기 때문에 만든후 쓰지 못한 많은 양이 사용되지 못하는 단점이 있습니다.
두번째 FBS는 근본적인 문제가 XM 한국어 | 커뮤니티 공유 경험, 팁 및 요령 있는데 이것은 FBS가 nutrients가 다량으로 들어있어 항상 bacterial contamination에 취약한 단점을 가지고 있습니다. 이를 막기 위해 항생제를 넣어주지만 세균감염을 100% 막아줄수는 없습니다.
위의 문제를 해결한 제품이 Revive Organtech사의 Cryo-GOLD입니다.
Cryo-GOLD는 serum free, protein free, animal origin free, fully defined 동결 보존액입니다.
Cryo-GOLD는 두가지 큰 특징이 있습니다.
Bacterial contamination free and DMSO toxicity free cell/tissue freezing media입니다.
위 제품을 사용하시면 저렴한 가격과 편리함 그리고 높은 효율, 사용의 장점들로 인해 중요한 cell stock을 보관하는데 많은 도움이 될것으로 사료됩니다.
현재 위 제품은 Stemgent, Allcells, System Bioscience, MIT iPS core, Salk Institute, ReproCELL, USC, UC Irvine, Invitrix, Thermo Scientific사등에서 사용되고 있습니다.
마치 제품 홍보 스럽지만 Z모사에서 나오는 셀X커 (영어지만 홍보하는 것 같이 짙어보일까봐서 한글로; 저는 그냥 일반 연구원입니다~)
요즘 FBS, BCS 등등의 가격이 올라가면서
점점 cell freezing에서 serum을 넣는 것도 아끼고 싶고
cell 을 freezing container에 isopropyl-alchohol 넣고 냉장고 옮겼다가
다시 deep freezer에 다시 넣는 게 귀찮고 까먹고 갈 때가 가끔 있는데
때론 이런 제품도 아주 유용하다고 생각합니다.
일정량의 셀 수를 centrifuge하고 셀 수만큼 시약을 넣고 바로 deep freezer에 넣어 -70에
보관하면 동결보존이 끝나더라구요.
cell culture 하시는 분들 중에 이런 방식의 스케쥴 관리가 필요하다면
이용해보시는 것도 좋다는 생각이 드네요.
물론 serum과 DMSO가 포함된 제품이라 다시 thawing 할 때 빨리 구출하는 과정은 같더라구요.
안녕하세요~
Mammalian cell 을 가지고 연구하고 있습니다~
대부분 이전의 DMSO 사용부터~ 요즘의 anti freezing agent 에 이르기까지
각자 나름의 재료들이 있을거라 생각되는데요~
1. DMSO 농도 : 10%
여러 암세포 cell line, MEF, 신경세포주 등등 stock 해보았으르 때 DMSO 농도는 10 % 가 가장 좋았습니다
2. FBS 농도 : 40%
세포 배양시 배지에 첨가되는 그 FBS! 장기보관할 시 FBS를 40 % 첨가하면 좋았습니다.
3. 세포 농도 : 50%
총 1 ml vol.으로 만들 때 stock만들 세포를 down 시킨 후, antibiotics +/FBS + media를 500 ul 넣어 부유시킨 후 만들면 좋았습니다
4. 종합 의견
위와같은 농도로 하되,
1) DMSO와 FBS는 mixture를 만들어서 세포를 부유시킨것과 섞는 것이 좋습니다
2) 섞을 때 pipetting을 충분히 해줍니다
3) 녹일 때는 37 도 water bath에서 단시간에 녹이고, 얼음이 XM 한국어 | 커뮤니티 공유 경험, 팁 및 요령 살짝 보일때 꺼냅니다
4) antibiotics +/FBS + media 13 ml이 든 conical tube에 cell mixture를 한방울 씩 떨어뜨린 후, spin down 합니다
2. 세포 보관 기간 :
- 질소(LN2)탱크 보관 시 장기 보관 (단, 질소의 양이 적절히 유지 되어야함)
- 약 -70도 Deepfreezer 에서 2개월로 잠시 보관한 후 다시 풀 때 사용. (최고 6 ~ 12개월이지만 damage를 받는 것같음 : Cell death나 cycle delay 등의 영향을 주는 것을 확인).
3. 세포 동결 시 세포의 density (1~10*106 정도). 일반 적으로 100 cm2 dish에 70~80%
(너무 많을 경우 condition 저하, 어는 속도 변화에 따른 damage, 적을 경우 이상 없었음)
4. 동결 방법
(1) 100 cm2 dish 세포70~80% density로 배양한 뒤 1 dish당 1 cryo tubue를 준비
(2) Harvest 후 spin down 하고 media를 버림.
(3) DMSO(외부에서 뚜껑 열지 않은 것), Fetal bovine serum(FBS) 준비 후 10%+90%로 섞음 (FBS 비율은 30%까지 줄여도 되지만 DMSO는 10~15% 유지. 나머지는 Culture media대체 가능). 저희 랩에서는Primary cell line은 FBS 90%로 얼립니다.
(4) 섞은 freezing media를 pellet에 잘 resuspending하고 tube에 옮김 (1 tube당 1ml로 만듬)
(5) 세포를 얼릴 때 중요한 점: 1분당 1도씩 내려가게 하기.
방법 1 : 적절한 굵기의 스티로폼 박스나, 티슈를 cryo tube 주위를 감싼 뒤 -20도 냉장고에 1~2시간 보관 -> -70도 deepfreezer에 overnight -> 질소(LN2) 탱크로 이동
(일정한 속도로 내려가진 않지만 어느정도 안정적인 방법)
방법 2 : 50ml conical tube에 Isopropanol을 넣는다 (Isopropanol은 냉동시 분당 1도씩 떨어지는 것으로 알고있습니다.) -> Cryo tube에 연필로 라벨링한다.(Isopropanol에 넣으면 일반적인 펜이나 잉크류는 쉽게 지워집니다.) -> tube를 conical tube에 집어넣는다 -> -70도 deepfreezer에 overnight한다 -> LN2 탱크로 이동 (일정한 속도로 내려가나 여러 개를 할 경우 손이 많이가고 연필로 labeling 해야한다.)
방법 3 : Thermo에서 판매 하고잇는 Isopropanol을 이용한 Cell freezer인 Mr. Frosty Freezing Contaner를 사용한다. 1ml과 5ml전용 박스가있는데 둥근 모양이며 한번에 18개를 넣을 수 있다. (사용법은 방법 2와 같으나 Isopropanol을 겉면에 넣고 씌운뒤 vial을 넣기 때문에 펜으로 labeling하여도 지워지지 않고 편하게 많은 cell을 얼릴 수있다. (장점 : 일정한 속도로 온도가 내려간다. 단점 : Isopropanol을 사용할 경우 비용이 지속적으로 들며, 냄새 처리 문제 등이 있다.)
방법 4 : CoolCell® LX 를 사용한다. Isopropanol 과 같은 alcohol을 사용하지 않고 단순한 열 보호 작용을 이용하는 것같다. 스티로폼 같은건데 딱딱하고 아무런 부가 재료가 들어가지 않고 단순히 cryo tube 12개정도를 넣고 사용하는데 대단히 편하다. 바로 -70도 deepfreezer에 넣은 뒤 overnight 하고 꺼낸 뒤 질소 탱크 옮기면 된다.
1. Freezing media
브랜드: wako
품명: Bambanker
특징: -20’C 에 pre-freezing 하지 않고 바로 deepfreezer 에 넣어도 되는 간편한 format
2. CoolCell
브랜드: biocision
품명: CoolCell
특징: 1분에 1도씩 온도를 떨어뜨려 cell damage를 최소화 하는 Freezing container
3. Thawstar
브랜드: biocision
품명: Thawstar
특징: water bath에서 cell을 녹일 시 발생할 수 있는 문제점을 극복하고, 표준화된 프로토콜을 제공하는 전 세계 유일한 thawing 장비
추가로 Biocision사에서는 샘플(Cell 포함)을 얼리고 녹이고 또 온도를 유지시키는데 필요한 대부분의 제품을 취급하고 있으며, 가장 표준화된 방법으로 샘플을 준비할 수 있도록 모든 solution을 제공하고 있습니다.
1. Collect and concentrate cells
- 배양 하고 있는 Cell을 harvest 하는 단계
2. Resuspend cell pellet in Cryopreservation media
- 세포를 안정한 상태로 보관할 수 있는 Freezing media로 Cell을 resuspension 시키는 단계
3. Controlled cooling -1℃/min to -80℃
- LN2에 바로 보관하기 전에 -80도까지 천천히 세포를 얼리는 단계로 초저온냉동고(deep freezer) 보관
4. Liquid nitrogen storage
- 장기적인 보관을 XM 한국어 | 커뮤니티 공유 경험, 팁 및 요령 위해 액체질소로 옮기는 단계
5. Thawing cell
- 액체질소에 보관중인 세포를 다시 사용하고자 할 때, 세포를 해동하는 과정
각 단계에서 사용할 수 있는 제품은 "관련제품" 항목을 참고 부탁 드립니다.
1. Detach the cell by trypsinization
2. Count the cell # and collect the cell with centrifuge (700 rpm, 3 min)
3. Resuspend the cell with freezing medium
4. Transfer 1 ml of cell suspension to cryovial tube
5. Insert the tube in styrofoam tube rack and store at -80 o C over night
6. Transfer the tube in liquid nitrogen tank
아마 방법을 크게 다를게 없을 것입니다.
다만 highlight한 5번 단계에서 isopropanol tank 대신에 스티로폼으로 된 tube rack을 사용한다는 것입니다.
좀 더 구체적으로 설명을 드리면 똑같은 size의 스티로폼 tube rack 2개가 필요합니다.
두 tube rack을 아래위로 겹치면 칸이 아래위로 일치하게 맞물리는지 확인하는 지 확인하고
서로 맞물린다면 아마도 밀착이 될 것입니다.
위의 rack이 준비가 되었다면 cryovial을 아래 rack에 꽂고 그 위에 다른 rack을 겹쳐서 덮으면 됩니다. 그리고 최대한 밀착을 시킨 후 tape로 겹쳐지는 부분을 돌아가면서 단단히 붙인 후
deep freezer에 넣으면 끝입니다.
isopropanol이 없어서 고민인 실험실이라면 추천하는 방법입니다.
저도 처음엔 XM 한국어 | 커뮤니티 공유 경험, 팁 및 요령 XM 한국어 | 커뮤니티 공유 경험, 팁 및 요령 의구심이 들었으나 한번 해보고 난 뒤에는 꿀팁이라는 생각이 들 정도로 괜찮은 방법입니다.
미국에서 학위하신 동료 박사님께서 알려주신 방법인데 참 유용한 tip인것 같습니다.
또 다른 한가지로는, 세포를 얼리는 것도 역시 중요하지만, 세포를 녹이는 방법 역시 세포의 생존율과 좋은 컨디션을 유지하는데 필수적인 요소입니다.
세포를 얼릴땐 가능한한 천천히 얼려주고, 반대로 세포를 녹일 때에는 가능한한 최대한 빨리 녹여주어야 합니다.
세포를 얼릴때 가장중요한것은 천천히 얼리는것 (분당 1도씩내려가게)입니다.
그리고 배지조성도 중요합니다.
연구실에서 간단하고 안전하게 할수있는 cell stock법을 간단히 알려드리겠습니다.
동결배지조성: 50% culture media, 40% FBS, 10% DMSO
1. 충분한 수의 세포를 동결배지로 suspension한 후 1 mL씩 cryo-vial에 넣는다.
2. Cryo-vial을 꼭 닫은후 연필로 label 한다.
3. 50 mL conical tube에 isopropanol을 채운다.
4. Cryo-vial을 isopropanol 들어있는 50 mL conical tube에 퐁당 넣는다.
5. 50 mL conical tube를 꼭 닫은후 -70''C freezer에 하루정도 보관한다.
6. 다음날 50 mL tube에서 Cryo-vial을 꺼내서 liquid nitrogen tank에 넣어 보관한다.
이렇게 하시면 일반적인 세포들은 1년이상 건강하게 보관할수있습니다.
흠..님글 발췌
일반적으로 세포주인 경우 -70도에서 보관시 약 6개월까지는 크게 문제는 되지 않습니다.
간혹 1년간 보관도 괜찮은 경우도 있긴 하지만, deepfreezer를 자주 여는 경우에는 이 기간보다 더 짧아질 수도 있습니다. 그리고, 몇몇 약한 세포나 Transfection을 위한 세포인 경우에는 LN2 보관을 해야 합니다.
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6월 17일에 철회를 신청했는데 아직 받지 못했습니다. FBS는 이제 사기 플랫폼이 됩니다.
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